Hadí jed obsahuje enzýmy, ktoré hydrolyzujú karboxyesterové väzby.Substrátmi pre hydrolýzu sú fosfolipidy, acetylcholín a aromatický acetát.Tieto enzýmy zahŕňajú tri druhy: fosfolipázu, acetylcholínesterázu a aromatickú esterázu.Arginín esteráza v hadom jede dokáže hydrolyzovať aj syntetický arginín či lyzín, v prírode však hydrolyzuje najmä proteínové peptidové väzby, patrí teda medzi proteázy.Tu diskutované enzýmy pôsobia iba na esterové substráty a nemôžu pôsobiť na žiadnu peptidovú väzbu.Spomedzi týchto enzýmov sú biologické funkcie acetylcholínesterázy a fosfolipázy dôležitejšie a boli plne študované.Niektoré hadie jedy majú silnú aromatickú esterázovú aktivitu, ktorá môže hydrolyzovať p-nitrofenyletylester, a- alebo P-naftalénacetát a etylester indolu.Stále nie je známe, či je táto aktivita produkovaná nezávislým enzýmom alebo známym vedľajším účinkom karboxylesterázy, nehovoriac o jej biologickom význame.Keď sa jed Agkistrodon halys Japonicus nechal reagovať s p-nitrofenyletylesterom a indoletylesterom, hydrolyzáty p-nitrofenolu a indolfenolu sa nenašli;Naopak, ak tieto estery reagujú s hadím jedom kobry Zhoushan poddruhu a hadím jedom Bungarus multicinctus, rýchlo sa hydrolyzujú.Je známe, že tieto kobrie jedy majú silnú cholínesterázovú aktivitu, ktorá môže byť zodpovedná za hydrolýzu vyššie uvedených substrátov.V skutočnosti Mclean a spol.(1971) uvádza, že mnohé hadie jedy patriace do čeľade kobry môžu hydrolyzovať etylester indolu, etylester naftalénu a ester butylnaftalénu.Tieto hadie jedy pochádzajú z: kobry, kobry čiernohrdlej, kobry čiernej, kobry zlatej, kobry egyptskej, kobry kráľovskej, kobry zlatej, mamby čiernej a mamby bielej (D. aw ešte pozná štrkáča východného kosoštvorca
Hadí jed môže hydrolyzovať metylindoletylester, ktorý je substrátom na stanovenie aktivity cholínesterázy v sére, ale tento hadí jed nevykazuje aktivitu cholínesterázy.To ukazuje, že v kobrom jede je neznáma esteráza, ktorá sa líši od cholínesterázy.Na pochopenie podstaty tohto enzýmu je potrebná ďalšia separačná práca.
1, Fosfolipáza A2
(I) Prehľad
Fosfolipáza je enzým, ktorý dokáže hydrolyzovať glycerylfosfát.V prírode existuje 5 druhov fosfolipázy, menovite fosfolipáza A2 a fosfolipáza
A., fosfolipáza B, fosfolipáza C a fosfolipáza D. Hadí jed obsahuje hlavne fosfolipázu A2 (PLA2), niekoľko hadích jedov obsahuje fosfolipázu B a ďalšie fosfolipázy sa nachádzajú najmä v tkanivách zvierat a baktériách.Obr. 3-11-4 ukazuje miesto pôsobenia týchto fosfolipáz na hydrolýzu substrátu.
Spomedzi fosfolipáz bola viac študovaná PLA2.Môže to byť najviac študovaný enzým v hadom jede.Jeho substrátom je esterová väzba na druhej pozícii Sn-3-glycerofosfátu.Tento enzým sa široko nachádza v hadom jede, včelom jede, jede škorpióna a živočíšnych tkanivách a PLA2 je hojne zastúpený v štyroch rodinných hadích jedoch.Pretože tento enzým rozkladá červené krvinky a spôsobuje hemolýzu, nazýva sa aj „hemolyzín“.Niektorí ľudia tiež nazývajú PLA2 hemolytickú lecitinázu.
Ludeeke prvýkrát zistil, že hadí jed dokáže produkovať hemolytickú zlúčeninu pôsobením na lecitín prostredníctvom enzýmov.Neskôr Delezenne a spol.dokázal, že keď kobrí jed pôsobí na konské sérum alebo žĺtok, vytvára hemolytickú látku.Teraz je známe, že PLA2 môže priamo pôsobiť na fosfolipidy membrány erytrocytov, pričom ničí štruktúru membrány erytrocytov a spôsobuje priamu hemolýzu;Môže tiež pôsobiť na sérum alebo pridaný lecitín za vzniku hemolytického lecitínu, ktorý pôsobí na červené krvinky za vzniku nepriamej hemolýzy.Hoci PLA2 je hojne zastúpený v štyroch rodinách hadích jedov, obsah enzýmov v rôznych hadích jedoch je mierne odlišný.Štrkáč (C
Hadí jed vykazoval iba slabú aktivitu PLA2.Tabuľka 3-11-11 ilustruje porovnanie aktivity PLA2 10 hlavných jedov jedovatých hadov v Číne.
Tabuľka 3-11-11 Porovnanie aktivít fosfolipázy VIII 10 hadích jedov v Číne
Hadí jed
Uvoľňovanie tuku
kyselina alifatická,
Cjumol/mg)
Hemolytická aktivita CHU50/^ g * ml)
Hadí jed
Uvoľnite mastné kyseliny
(^raol/mg)
Hemolytická aktivita “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
jedenásť
Mikracefálny ophis
päť bodov jedna nula
kalyspallas
8. 68
dvetisícosemsto
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tri bod osem dva
stoštyridsať
Bnugarus fasctatus
7,56
dvestoosemdesiat
B. multicinctus
jeden bod deväť šesť
dvestoosemdesiat
Viper a russelli
sedem bodov nula tri
T, mucrosquamatus
jeden bod osem päť
Siamensis
T. stejnegeri
0,97
(2) Separácia a čistenie
Obsah PLA2 v hadom jede je veľký a je stabilný voči teplu, kyselinám, zásadám a denaturačným prostriedkom, takže je ľahké ho čistiť a oddeľovať PLA2.Bežnou metódou je najprv vykonať gélovú filtráciu surového jedu, potom vykonať iónomeničovú chromatografiu a ďalší krok možno zopakovať.Je potrebné poznamenať, že lyofilizácia PLA2 po iónovo-výmennej chromatografii by nemala spôsobiť agregáciu, pretože proces lyofilizácie často zvyšuje iónovú silu v systéme, čo je dôležitý faktor spôsobujúci agregáciu PLA2.Okrem vyššie uvedených všeobecných metód boli prijaté aj nasledujúce metódy: ① Wells a kol.② Substrátový analóg PLA2 bol použitý ako ligand pre afinitnú chromatografiu.Tento ligand sa môže viazať na PLA2 v hadom jede s Ca2+.Ako eluent sa väčšinou používa EDTA.Po odstránení Ca2+ sa afinita medzi PLA2 a ligandom znižuje a môže sa oddeliť od ligandu.Iní používajú ako eluent 30 % organický roztok alebo 6 mol/l močoviny.③ Hydrofóbna chromatografia sa uskutočnila s PheiiylSephar0SeCL-4B, aby sa odstránili stopy PLA2 v kardiotoxíne.④ Anti PLA2 protilátka bola použitá ako ligand na uskutočnenie afinitnej chromatografie na PLA2.
Doteraz sa podarilo vyčistiť veľké množstvo hadieho jedu PLAZ.Tu a kol.(1977) uviedli PLA2 purifikovanú z hadieho jedu pred rokom 1975. V posledných rokoch bolo každoročne publikovaných veľké množstvo článkov o separácii a čistení PLA2.Tu sa zameriavame na separáciu a čistenie PLA čínskymi vedcami.
Chen Yuancong a kol.(1981) oddelili od jedu Agkistrodon halys Pallas v Zhejiang tri druhy PLA2, ktoré možno rozdeliť na kyslé, neutrálne a alkalické PLA2 podľa ich izoelektrických bodov.Podľa toxicity je toxickejšia neutrálna PLA2, ktorá bola identifikovaná ako presynaptický neurotoxín Agkistrodotoxín.Alkalický PLA2 je menej toxický a kyslý PLA2 nemá takmer žiadnu toxicitu.Wu Xiangfu a kol.(1984) porovnávali charakteristiky troch PLA2, vrátane molekulovej hmotnosti, zloženia aminokyselín, N-konca, izoelektrického bodu, tepelnej stability, enzýmovej aktivity, toxicity a hemolytickej aktivity.Výsledky ukázali, že mali podobnú molekulovú hmotnosť a tepelnú stabilitu, ale mali významné rozdiely v iných aspektoch.Z hľadiska enzýmovej aktivity bola aktivita kyslého enzýmu vyššia ako aktivita alkalického enzýmu;Hemolytický účinok alkalického enzýmu na červené krvinky potkanov bol najsilnejší, nasledoval neutrálny enzým a kyslý enzým, ktorý sa ťažko hemolyzoval.Preto sa špekuluje, že hemolytický účinok PLAZ súvisí s nábojom molekuly PLA2.Zhang Jingkang a kol.(1981) vytvorili kryštály Agkistrodotoxínu.Tu Guangliang a kol.(1983) uvádza, že toxická PLA s izoelektrickým bodom 7,6 bola izolovaná a purifikovaná z jedu Vipera rotundus z Fujianu a jej fyzikálne a chemické vlastnosti, zloženie aminokyselín a sekvencia 22 aminokyselinových zvyškov na N -boli určené koncovky.Li Yuesheng a kol.(1985) izolovali a purifikovali ďalšiu PLA2 z jedu Viper rotundus vo Fujian.Podjednotka PLA2 * je 13 800, izoelektrický bod je 10,4 a špecifická aktivita je 35/xnioI/miri mg。 S lecitínom ako substrátom je optimálne pH enzýmu 8,0 a optimálna teplota je 65 °C. LD5 injikovaný intravenózne myšiam.Je to 0,5 ± 0,12 mg/kg.Tento enzým má zjavné antikoagulačné a hemolytické účinky.Toxická molekula PLA2 pozostáva zo 123 zvyškov 18 druhov aminokyselín.Molekula je bohatá na cysteín (14), kyselinu asparágovú (14) a glycín (12), ale obsahuje iba jeden metionín a jej N-koniec je serínový zvyšok.V porovnaní s PLA2 izolovaným Tuguangom sú molekulová hmotnosť a počet aminokyselinových zvyškov týchto dvoch izoenzýmov veľmi podobné a zloženie aminokyselín je tiež veľmi podobné, ale počet zvyškov kyseliny asparágovej a prolínu je trochu odlišný.Hadí jed kobry kráľovskej z Guangxi obsahuje bohaté množstvo PLA2.Shu Yuyan a kol.(1989) izolovali z jedu PLA2, ktorý má špecifickú aktivitu 3,6-krát vyššiu ako pôvodný jed, molekulovú hmotnosť 13 000, zloženie 122 aminokyselinových zvyškov, izoelektrický bod 8,9 a dobrú tepelnú stabilitu.Z pozorovania účinku základnej PLA2 na červené krvinky elektrónovým mikroskopom je zrejmé, že má zjavný účinok na membránu ľudských červených krviniek, ale nemá žiadny zjavný účinok na červené krvinky kôz.Táto PLA2 má zjavný retardačný účinok na elektroforetickú rýchlosť červených krviniek u ľudí, kôz, králikov a morčiat.Chen a kol.Tento enzým môže inhibovať agregáciu krvných doštičiek indukovanú ADP, kolagénom a sodnou soľou kyseliny arachidónovej.Keď je koncentrácia PLA2 10/xg/ml - 100 ug/ml, agregácia krvných doštičiek je úplne inhibovaná.Ak boli ako materiály použité premyté krvné doštičky, PLA2 nemohla inhibovať agregáciu pri koncentrácii 20 mg/ml.Aspirín je inhibítor cyklooxygenázy, ktorý môže inhibovať účinok PLA2 na krvné doštičky.PLA2 môže inhibovať agregáciu krvných doštičiek hydrolýzou kyseliny arachidónovej na syntézu tromboxánu A2.Konformácia roztoku PLA2 produkovaného jedom Agkistrodon halys Pallas v provincii Zhejiang bola študovaná pomocou cirkulárneho dichroizmu, fluorescencie a UV absorpcie.Experimentálne výsledky ukázali, že konformácia hlavného reťazca tohto enzýmu bola podobná konformácii rovnakého druhu enzýmu z iných druhov a rodov, konformácia kostry mala dobrú tepelnú odolnosť a štrukturálna zmena v kyslom prostredí bola reverzibilná.Kombinácia aktivátora Ca2+ a enzýmu neovplyvňuje prostredie tryptofánových zvyškov, zatiaľ čo inhibítor Zn2+ pôsobí naopak.Spôsob, akým hodnota pH roztoku ovplyvňuje aktivitu enzýmu, je odlišný od vyššie uvedených činidiel.
V procese čistenia hadieho jedu PLA2 je zjavným javom, že hadí jed obsahuje dva alebo viac elučných píkov PLA2.Tento jav možno vysvetliť nasledovne: ① vďaka existencii izoenzýmov;② Jeden druh PLA2 je polymerizovaný do rôznych zmesí PLA2 s rôznymi molekulovými hmotnosťami, z ktorých väčšina je v rozmedzí 9 000 ~ 40 000;③ Kombinácia PLA2 a iných zložiek hadieho jedu komplikuje PLA2;④ Pretože je amidová väzba v PLA2 hydrolyzovaná, mení sa náboj.① A ② sú bežné, len s niekoľkými výnimkami, ako je PLA2 v CrWa/w hadom jede
Existujú dve situácie: ① a ②.Tretí stav bol nájdený v PLA2 v jede nasledujúcich hadov: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, zmija palestínska, zmija piesková a strašný štrkáč km.
Výsledkom prípadu ④ je zmena rýchlosti migrácie PLA2 počas elektroforézy, ale zloženie aminokyselín sa nemení.Peptidy môžu byť rozbité hydrolýzou, ale vo všeobecnosti sú stále spolu viazané disulfidovými väzbami.Jed štrkáča východného obsahuje dve formy PLA2, nazývané typ a a typ p PLA2.Rozdiel medzi týmito dvoma typmi PLA2 je len jedna aminokyselina, to znamená, že glutamín v jednej molekule PLA2 je nahradený kyselinou glutámovou v druhej molekule PLA2.Hoci presný dôvod tohto rozdielu nie je jasný, všeobecne sa predpokladá, že súvisí s deamináciou PLA2.Ak sa PLA2 v palestínskom jede zmije udržiava v teple so surovým jedom, koncových skupín v molekulách jeho enzýmov bude viac ako predtým.Z C PLA2 izolovaný z hadieho jedu má dva rôzne N-konce a jeho molekulová hmotnosť je 30 000. Tento jav môže byť spôsobený asymetrickým dimérom PLA2, ktorý je podobný symetrickému diméru tvorenému PLA2 v jede štrkáča východného. a západný štrkáč diamantový.Ázijská kobra sa skladá z mnohých poddruhov, z ktorých niektoré nie sú veľmi presne klasifikované.Napríklad to, čo sa kedysi nazývalo vonkajším kaspickým poddruhom kobry, je teraz známe
Malo by sa pripísať vonkajšej kaspickej kobre.Keďže existuje veľa poddruhov a sú navzájom zmiešané, zloženie hadieho jedu sa veľmi líši v dôsledku rôznych zdrojov a vysoký je aj obsah izoenzýmov PLA2.Napríklad jed kobry
Najmenej 9 druhov izoenzýmov PLA2 r ^ ll druhov bolo nájdených v a 7 druhov izoenzýmov PLA2 sa našlo v jede kobry poddruhu Kaspický.Durkin a kol.(1981) študovali obsah PLA2 a počet izoenzýmov v rôznych hadích jedoch, vrátane 18 kobrích jedov, 3 jedov mamby, 5 jedov zmije, 16 jedov štrkáča a 3 jedov morského hada.Vo všeobecnosti je aktivita PLA2 kobrieho jedu vysoká, s mnohými izoenzýmami.Aktivita PLA2 a izozýmy jedu vretenice sú stredné.Aktivita PLA2 jedu mamby a jedu štrkáča je veľmi nízka alebo žiadna aktivita PLA2.PLA2 aktivita jedu morského hada je tiež nízka.
V posledných rokoch nebolo hlásené, že by PLA2 v hadom jede existuje vo forme aktívneho diméru, ako je napríklad štrkáč východný rhombophora (C. hadí jed obsahuje PLA2 typu a a typu P, pričom obe sú zložené z dvoch rovnakých podjednotiek a iba dimeráza má
Aktivita.Shen a kol.tiež navrhli, že aktívnou formou enzýmu je iba dimér PLA2 hadieho jedu.Štúdium priestorovej štruktúry tiež dokazuje, že PLA2 západného štrkáča diamantového existuje vo forme diméru.Rybožravá zlúčenina
Existujú dva rôzne PLA ^ Ei a E2 hadieho jedu, v ktorých 仏 existuje vo forme diméru, dimér je aktívny a jeho disociovaný monomér je neaktívny.Lu Yinghua a kol.(1980) ďalej študovali fyzikálne a chemické vlastnosti a reakčnú kinetiku E. Jayanthi a kol.(1989) izolovali zásaditý PLA2 (VRVPL-V) z jedu vretenice.Molekulová hmotnosť monoméru PLA2 je 10 000, ktorý má letálne, antikoagulačné a edémové účinky.Enzým môže polymerizovať polyméry s rôznymi molekulovými hmotnosťami za podmienok PH 4,8 a stupeň polymerizácie a molekulová hmotnosť polymérov sa zvyšujú so zvyšujúcou sa teplotou.Molekulová hmotnosť polyméru generovaného pri 96 °C je 53 100 a aktivita PLA2 tohto polyméru sa zvýši o dva
Čas odoslania: 18. novembra 2022